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공학 생물학 및 실험 레포트

1. 제목
The Bradford Method for Protein Quantitation

2. 준비물
Bradford 시약
Protein Standard Solution
Spectrophotometer와 Quartz cuvette, Pipet
Milk, 증류수
ep tube
BSA Protein(standard)

3. 실험 과정
Milk를 증류수를 이용하여 , , 원액의 비율로 dilution한다.
Bradford 시약을 1㎖씩 ep tube에 7개 넣는다.
Standard Soulution을 0㎕, 2㎕, 4㎕, 6㎕씩 tube에 넣는다.
diluted milk를 5㎕씩 ep tube에 넣는다.
거품이 나지 않도록 천천히 뒤집으며 섞는다.
각각 시료를 1.5㎖ cuvettes에 1㎖씩 넣는다.
7.595㎚ 파장에서 Standard Solution의 흡광도를 측정한 후 기록한다.
나머지 시료의 흡광도를 측정한 후 기록한다.

4. 서론
Bradford Method는 산성 용액에서 불그스름한 갈색을 띄는 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) 염료의 흡광도 변화를 측정한다. CBBG가 free dye형태로 있을 때의 최대 흡광은 465㎚(빨강)이지만, 단백질의 아미노산과 결합하여 anionic form일 때의 최대 흡광도은 595㎚(파랑)인 점을 이용한다. 595nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하게 된다. CBBG의 음이온이 단백질의 양이온 부분과 정전기적 인력에 의한 결합을 한다. 각각의 Protein 분자에 결합된 CBBG dye의 수는 대략 Protein 에 있는 양이온 수와 비례한다. 단백질에 결합한 CBBG는 용액을 갈색에서 푸른색으로 변하게 한다.
Bradford Method는 매우 빠르고 비용이 낮다는 장점이 있으며, 생체고분자 물질 중 단백질에 매우 특이적이다. 하지만 단백질의 종류, 즉 아미노산의 조성에 따라 반응 정도가 달라지기 때문에 Standard Soulution의 선택이 매우 중요하다. 1시 방해성분으로 알려진 것은 Triton X-100과 황산도데실나트륨(SDS) 이다. CBBG를 사용할 때에는 인산과 메탄올의 혼합물로 된 것을 사용한다. CBBG는 사용 전에 증류수로 5배가량 희석 후 여과 단계를 거쳐 실온에서 보관한다.

5. 결과
Standard curve

diluted milk 단백질 농도
1) 비율의 diluted milk : 0.166 〓 166
2) 비율의 diluted milk : 1.79 〓 1790
3) undiluted milk : 6.986 〓 6986

undiluted milk의 단백질 농도가 6986 밖에 안 되는 이유
시료 용액의 흡광도는 대조구의 흡광도에 대한 시료 흡광도의 비율이다. 그러므로 알고 있는…(생략)
 

   
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